細胞光毒性試驗材料與試劑

（一）光源類型

選擇合適的光源必須符合的標準包括：光源發(fā)射的光波長能被受試物吸收（吸收光譜），光的劑量（在一個合理的暴露時間內能達到的劑量）能滿足已知光毒性化學物質的檢測。此外的波長和劑量不能有損于試驗系統(tǒng)，如（紅外區(qū)域）熱量散發(fā)或類似UVB波長的高細胞毒性的干擾，因此光源要求能夠穩(wěn)定地釋放UVA和可見光波長，推薦使用LUYOR-3450細胞光毒性輻照儀。

由于的太陽光模擬器都發(fā)射出相當數(shù)量的UVB，應經(jīng)過適當?shù)倪^濾使UVB＜0.1J/cm2。透過96孔組織培養(yǎng)板蓋的光強度建議為1.7mW/cm2光強度（即5J/cm2）劑量。

（二）細胞株

選用永生化小鼠成纖維細胞系—Balb/c 3T3成纖維細胞。要求細胞來源必須是具有公信力的機構且能確保細胞品質穩(wěn)定。

由于細胞對UVA的敏感性隨傳代數(shù)的增加可能增高，建議用于試驗的Balb/c 3T3成纖維細胞傳代次數(shù)好少于100次。

測試單位若自行培養(yǎng)細胞株，則須定期檢測細胞株對UV光的敏感性，并確保無支原體污染。

（三）培養(yǎng)基

采用DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清或小牛血清（10%）、谷氨酰胺（4mmol/L）、抗生素（青霉素和鏈霉素，濃度分別為100IU和100μg/mL），在36.5℃—37.5℃, 5%—7.5%CO2條件下培養(yǎng)。

（四）溶劑的選擇

在測定前，應首先評價受試物的溶解度，以選擇佳溶劑體系。溶劑必須不與受試物發(fā)生化學反應，不影響細胞活性。

能溶于水且濃度達1000μg/mL的受試物可溶于預先加溫（37℃）和滅菌的磷酸鹽緩沖液（EBSS或PBS）。水中溶解度有限的受試物（＜1000μg/mL）可用二甲基亞砜（DMSO）或乙醇（ETOH）等溶劑溶解。使用DMSO或ETOH作為溶劑時，其終濃度不得超過總體積的1%（v/v），陰性對照組和受試物組溶劑的體積比例應相同。

（五）受試物的配制

受試物必須在使用前新鮮配制。建議的化學物質操作和細胞處理初期都應避免受試物在光激活或光降解的光線條件下進行。

每次實驗應設空白對照、溶劑對照和陽性對照。

（六）受試物劑量的設置

需通過預實驗確定有光照和無光照條件下受試物的濃度范圍。用溶劑將受試物原液使用同一常數(shù)稀釋因子（如 ＝3.16）稀釋成8個濃度，相關濃度范圍應包括從大細胞毒性至幾乎無細胞毒性濃度（細胞存活率在20%—的范圍）。

如果預實驗結果表明在濃度等于1000μg/mL時仍未出現(xiàn)細胞毒性，則建議高濃度為1000μg/mL；若出現(xiàn)細胞毒性的濃度低于1000μg/mL時，有細胞毒性的濃度少于三種，則需要進行重復試驗或使用更小的稀釋因子，直至出現(xiàn)有細胞毒性的濃度至少三種。如果根據(jù)受試物的溶解度，高濃度不能達到1000μg/mL，則以大溶解度時的濃度作為高濃度，避免受試物在任何濃度出現(xiàn)沉淀。

如果在無光照條件下(-Irr)受試物在高濃度時仍然不具有細胞毒性，而在有光照條件下(+Irr)出現(xiàn)強烈細胞毒性，則在-Irr試驗和+Irr試驗中可采用不同的試驗濃度。

（七）中性紅（Neutral Red，NR）

化學名為3-氨基一7一二甲氨基一2一甲基吩嗪鹽酸鹽(3-amino-7-dime-2-thylamino-2-methylphenazine hydrochloride)，CAS編號:553-24-2；或藥品標準物質，編號：100460。

（八）中性紅溶液

1．中性紅原液。稱取0.4g中性紅染料，溶于100mL蒸餾水（室溫條件下可保存2個月）

2．中性紅使用液。在79mL DMEM培養(yǎng)液中加入1mL中性紅原液，即為使用液。中性紅終濃度為50μg/mL。

（九）中性紅解吸附溶液

將蒸餾水、乙醇、乙酸按49:50:1比例配制（現(xiàn)用現(xiàn)配，儲存不超過1小時）。